ImmuQuest抗体：C4d补体片段单克隆抗体

免疫荧光实验方案 - 甲醛固定

1. 从 Tcunit 收集细胞，并使用吸力从培养皿中取出培养基。

2. 用 1x PBS 清洗并去除。

3. 将细胞在预温 (37°C) 多聚甲醛中在定轨摇床上室温孵育 12 分钟。

4. 除去PFA并在1x PBS中的0.5% Triton X-100中在室温下孵育5分钟。

5. 准备封闭试剂，这也是抗体稀释液。

6. 在室温下用 1x PBS 洗涤细胞 2x，在轨道摇床上洗涤 4 分钟/洗涤。

7. 用 1% NCS 和 1x PBS 在室温下封闭 30 分钟。

8. 准备一抗（50μl/盖玻片）和湿染色室。

9. 在室温下用 lx PBS 清洗细胞 2x，并短暂风干。

10. 在染色室中、黑暗中、室温下与一抗一起孵育 1 小时。在此期间准备二抗。

11. 用 1x PBS 清洗细胞 5 次（更换烧杯 5 次/每个烧杯计数 5 次）

12. 在染色室中、黑暗中、室温下与二抗一起孵育 1 小时。

13. 用 1x PBS 清洗细胞 5x。

14. 坐于大皮。

溶液（染色当天新鲜配制）。

• * 1x 磷酸盐缓冲盐水。

• * 封闭试剂：1% NCS，溶于 1x PBS（使用新鲜的 10x PBS）。

• * 固定液：3.5% 多聚甲醛。

1.75g PFA 溶于 20 ml d.H2O 加 5 滴 1M NaOH 中。在 50-60°C 的热板上搅拌直至溶解。添加 4 滴 HCl 并检查 pH 指示条。 PH值应为7.4。用 d.H2O 补足体积至 25ml，并添加 25ml 2xPBS。添加到盖玻片之前检查 pH 值。

免疫荧光实验方案 - 甲醇/丙酮固定

1. 从 TCunit 收集细胞，并使用吸力从培养皿中取出培养基。

2. 用 1x PBS 清洗并去除。

3. 用冷甲醇:丙酮 1:1 在冰上固定细胞 10 分钟。

4. 准备封闭剂，这也是抗体的稀释剂。

5. 除去固定剂并在室温下用1x PBS洗涤细胞3x，在定轨摇床上洗涤4分钟/洗涤。

6. 在 RT 下用 1% NCS 和 1x PBS 封闭 30 分钟。

7. 准备一抗（50μl/盖玻片）和湿染色室。

8. 在 RT 下用 1 x PBS 清洗细胞 2x，并风干约 7 分钟。

9. 在染色室中在黑暗中与一抗一起在室温下孵育 1 小时。在此期间准备二抗。

10. 用 1x PBS 清洗细胞 5 次（更换烧杯 5 次/每个烧杯计数 5 次）

11. 在染色室中在黑暗中与二抗一起在室温下孵育 1 小时。

12. 用 1x PBS 清洗细胞 5x。

13. 坐于大皮。

溶液（染色当天新鲜配制）

• * 1x 磷酸盐缓冲盐水。

• * 封闭试剂：1% NCS 溶于 1x PBS（使用新鲜的 10x PBS）。

• * 固定液：甲醇:丙酮 1:1 冰冷。

蛋白质印迹实验方案

1. 将凝胶转移到 PDVF 或硝酸纤维素膜上

2. 将膜放入塑料托盘中，并在封闭缓冲液中搅拌一小时

3. 在洗涤缓冲液中冲洗

4. 在洗涤缓冲液加一抗中孵育一小时

5. 用洗涤缓冲液洗涤 6 X 5 分钟

6. 在加二抗的洗涤缓冲液中孵育一小时

7. 用洗涤缓冲液洗涤 6X 5 分钟

8. 检测（例如 ECL、Amersham 根据制造商说明）

洗涤缓冲液

PBS + 0.1% 吐温 20

封闭缓冲液

洗涤缓冲液+5%奶粉

所用抗体的浓度取决于每种抗体、抗原的量和所用的检测方法。一般来说，稀释度在几百倍到几千倍稀释范围内，但通常必须凭经验确定。