使用 3Dye 差异蛋白质组试剂进行蛋白质标记

差异蛋白质组学可以比较来自不同生物来源的大量蛋白质。通常的例子是经过处理和未经处理的细胞、不同的细菌菌株。即使蛋白质谱中的微小差异也可以通过差异蛋白质组学来发现。

Lumiprobe 3Dye 套件包含 Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 染料，它们的光谱不同，但迁移率匹配。因此，用这些染料标记的蛋白质在凝胶电泳中共同迁移。由于使用染料进行的蛋白质标记依赖于 NHS 酯化学，因此赖氨酸残基是标记的主要位点。

二维蛋白质组学的最佳实践意味着使用合并的内部对照样本，该样本本质上是在一个实验中分析的两个样本的混合物。内部对照样品用 Cyanine2 标记，分析样品用 Cyanine3 或 Cyanine5 标记（这两种染料可以互换）。

3Dye 试剂以 5 nmol、10 nmol 和 25 nmol 包装进行预先测量。染料被冻干以延长其保质期。每个包装在使用前均应用 DMF 重新配制。 DMF 质量对于实验和产品保质期至关重要。套件中的染料附带 DMF。

蛋白质混合物的制备是测定中变化最大、要求最高的部分。它超出了协议的范围，因为不同的样品需要非常不同的裂解条件才能获得适合检测的蛋白质混合物。本质上，被比较的两个样品应该在相同的条件下裂解以获得有意义的结果。一般来说，如果实验需要裂解，建议使用基于 CHAPS 的裂解溶液。

在比较两种蛋白质混合物的制备后，可以使用以下方案来实现标记：

1. 通过每 1 nmol 每种染料添加 1 μL DMF（来自试剂盒），制备每种染料的 1 mM 库存溶液。这些溶液在 -20°C 下可稳定保存三个月。为了确保保质期，在打开前将管干燥、全解冻，在关闭前尽可能用惰性气体吹扫。

2. 使用无胺缓冲液（NaHCO3、醋酸盐）或 Tris 缓冲液将蛋白质混合物 pH 调节至 8.5。在单独的小瓶中，准备三个用于标记的蛋白质样品：(1) 第一个蛋白质样品，(2) 第二个蛋白质样品，以及 (3) 两者的混合物（合并的内部对照）。每个样品中的蛋白质浓度理想情况下应为 5–10 mg/mL，但也可以使用低至 1 mg/mL 的浓度。每次反应取 50 μg 蛋白质。

3. 通过取等分的 1 mM 库存溶液并用 DMF 稀释至 0.4 mM 来制备染料工作溶液。

4. 将 1 μL 工作染料溶液添加到反应混合物中：Cyanine3 表示未处理，Cyanine5 表示处理过（反之亦然），Cyanine2 表示合并的内部对照。通过移入和移出混合每个反应，并在黑暗中放置 30 分钟。

5. 通过向每种溶液中添加 1 μL 10 mM 赖氨酸来停止反应（试剂盒中不包含该试剂，但该试剂很容易获得）。

6. 合并三个样品并运行 2D 凝胶。

7. 使用任何能够检测 Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 的成像仪进行分析。可以从凝胶上切下蛋白质斑点并通过质谱分析。