酪酰胺信号放大

该酪酰胺信号放大 (TSA) 方案可用于通过免疫染色或 原位杂交检测过氧化物酶标记样品中的信号。所有孵育均在摇床上进行。

试剂：

• 2-4% 甲醛，pH 7.4

• 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4

• PBT：0.1% Tween-20； PBS，pH 7.4

• 1 mM 叠氮*钠的 PBT 溶液

• 30 % H2O2

• 1 mg/ml荧光标记酪酰胺，标记 级 DMSO

可选：

• 硫酸葡聚糖 (DS)

• 4-碘苯酚

• 酸性甘氨酸缓冲液：0.1 M 甘氨酸； pH 2.0； 0.1% 吐温-20

协议：

1. 按要求的方式固定样品。通常，用冷的 2-4% 甲醛（pH 7.4）进行固定。用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和PBT （0.1% Tween-20；PBS，pH 7.4）清洗固定剂中的样品。

2. 通过将样品在 抑制溶液（PBT 中的 1 mM 叠氮*钠）中室温孵育 30-60 分钟来抑制内源过氧化物酶活性。

可选。可以使用 PBT 中的 3% H 2 O 2或 0.02 N HCl代替 1 mM 叠氮*钠进行抑制。对于后续的免疫化学，该阶段可以与阻断抗体的非特异性结合相结合。为此，必须将封闭血清或 1% BSA 添加到叠氮化物或 H 2 O 2 溶液中。

笔记！如果背景较低且进行原位杂交，则可以跳过此步骤；直接进入步骤4。

3. 在室温下，在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分钟，从抑制溶液中清洗样品。

4. 执行所有免疫化学或 原位杂交步骤，用过氧化物酶偶联抗体标记样品。

5. 室温下在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分钟，清洗样品以去除抗体。

6. 使用前立即制备反应缓冲液。为此，用 30% H 2 O 2将 PBT 稀释两次，每次 1:100，直至最终浓度为 0.003% (1:10000)。

可选。为了提高方法的灵敏度，可以将以下组分添加到反应混合物中（单独或组合）：

• 2% 硫酸葡聚糖 (DS) 用于增加反应混合物的粘度。

• 500 µg/ml 4-碘苯酚用于增强过氧化物酶反应。以 1:200 稀释储备液（100 mg/ml 乙醇溶液）使用更方便。

7. 将 1 至 10 μg/ml标记的酪酰胺添加到反应缓冲液中（最佳浓度必须通过实验确定）。通过摇动混合。

8. 将样品与反应缓冲液在黑暗中室温孵育 5-30 分钟（确切时间通过实验确定；可以以 15 分钟为起点）。

9. 将样品在抑制剂溶液（1 mM 叠氮*钠的 PBT 溶液）中在室温下避光孵育 10 分钟来终止反应。

10. 用 PBS 清洗样品 3 次，每次 10 分钟。

11. 要重复抗体-TSA 标记周期，请在室温下用酸性甘氨酸缓冲液（0.1% Tween-20；0.1 M 甘氨酸，pH 2.0）处理样品 10 分钟。该过程分离抗原结合的抗体，而不影响与蛋白质共价结合的酪酰胺。

12. 使用封固剂将样品封固在盖玻片下 。