PLA的工作原理

一、邻位连接技术（PLA）的工作原理？

 Duolink®邻位连接技术(PLA)是一种高特异性、高灵敏地原位检测内源性蛋白、蛋白修饰和蛋白互作的强大工具.该技术可轻松检测和定位未改造细胞和组织内单分子级别的蛋白靶标。一般先使用不同种属来源的两种一抗检测两个蛋白靶标（图1A）。接着用一对寡核苷酸标记的二抗（PLA探针/邻位探针）结合一抗（图1B）。再加入连接寡核苷酸，当一对邻位探针足够贴近时，连接寡核苷酸会与邻位探针对互补杂交，在连接酶的作用下形成封闭的环状DNA，作为滚环扩增(RCA)的模板（图1C）。接着DNA聚合酶以PLA探针为引物，以上述环状DNA为模板，通过RCA反应合成连环序列（图1D）。这使仍与PLA探针相连的序列信号扩大1000倍，方便进行信号定位。最后，用标记寡核苷酸与扩增子内的互补序列杂交（图1E），在荧光显微镜下表现为散点（PLA信号），实现可视化和定量分析（图1F）。Duolink® PLA技术可结合免疫荧光（即绿色、红色、远红或橙色检测）或免疫组化（即过氧化物酶催化反应）检测贴壁细胞、细胞离心涂片和组织切片。此外，Duolink® PLA技术还可结合流式细胞术检测血液或悬浮细胞，也可采用多孔板（例如，96或384孔板）搭配高内涵筛选成像仪进行高通量分析。Duolink® PLA 的高特异性、灵敏度和多功能性使其成为信号通路分析、药物筛选、IC50 测定和靶标验证的理想选择。

二、DUOLINK®邻位连接技术检测EGFR和HER2二聚化？

表皮生长因子受体（EGFR，ErbB1，HER1）和人表皮受体2（HER2，ErbB2，Neu）的二聚化是一种蛋白质相互作用（PPI）。EGFR和HER2是受体酪氨酸激酶ErbB家族的成员，在细胞分裂和死亡调控中起重要作用。影响其中任意一种蛋白质的表达或活性的突变与多种癌症的发生发展有关。当配体（如EGF）结合EGFR的胞外结构域时，EGFR受体激活并自磷酸化细胞质尾区。从而与ErbB家族其他成员形成同源(EGFR-EGFR)和异源（例如，EGFR-HER2）二聚体（图2）。二聚化及之后的磷酸化发生后，会募集一些衔接蛋白，进一步激活几个胞内信号通路，最终可调节基因转录，导致肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移和抗凋亡。