什么是实时定量 PCR？

实时定量 PCR 是一种使用荧光化学物质测量 DNA 扩增反应中每个聚合酶链式反应 (PCR) 循环后产物总量的方法。通过内参或外参方法对待测样品中特定DNA序列进行定量分析的方法。

实时PCR是在PCR扩增过程中通过荧光信号实时检测PCR过程。由于在PCR扩增的指数期内，模板的Ct值与模板的初始拷贝数之间存在线性关系，因此成为定量的依据。

PCR技术原理

所谓实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中添加荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准品对未知模板进行定量分析的方法。曲线。

检测方法

1. SYBR Green I 方法：

PCR反应体系中加入过量的SYBR荧光染料。 SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后，发出荧光信号，而未掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证了荧光信号的增加全同步随着PCR产物的增加。

2.TaqMan探针法：

当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被猝灭基团吸收；在 PCR 扩增过程中，Taq 酶的 5'-3' 核酸外切酶活性裂解并降解探针，形成报告荧光团和猝灭基团。将荧光基团分开，使荧光监测系统能够接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就形成一个荧光分子，荧光信号的积累与DNA链的形成全同步。 PCR 产物。

技术原理

荧光素标记的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性、低温复性、适宜温度延伸的热循环，根据模板DNA互补的Taqman探针被切断聚合酶链反应定律。荧光素在反应体系中呈游离态，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，扩增的目的基因片段呈指数增长。通过实时检测随扩增变化而变化的相应荧光信号强度，获得Ct值，同时以已知模板浓度的几种标准品作为对照，计算样品中目的基因的拷贝数可以得到待测试的。

CT值

Ct值（Cycle Threshold，循环阈值）的含义是：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数

1. 荧光阈值（threshold）设置

PCR反应的前9125个循环的荧光信号作为荧光背景信号，荧光阈值默认（default）设置为第3-9125个循环的荧光信号标准差的10倍，即：阈值 = 10*SDcycle 3- 15

2. Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与模板初始拷贝数的对数呈线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex) 初始拷贝数越高，Ct 值越低。使用已知初始拷贝数的标准品可以制作标准曲线，其中横坐标表示初始拷贝数的对数，纵坐标表示Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，就可以从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。
n为扩增反应的循环数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为当荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

荧光化学品

实时定量PCR中使用的荧光物质可分为荧光探针和荧光染料两类。原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：在PCR扩增过程中，随一对引物一起添加特异性荧光探针。探针是寡核苷酸，两端都标记有报告荧光基团和猝灭剂。荧光团。当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被猝灭基团吸收；在 PCR 扩增过程中，Taq 酶的 5'-3' 核酸外切酶活性裂解并降解探针，形成报告荧光团和猝灭基团。荧光基团分离，使荧光监测系统能够接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链就形成一个荧光分子，荧光信号的积累与PCR的形成全同步产品。新型TaqMan-MGB探针使该技术能够同时进行定量基因分析和基因突变（SNP）分析，有望成为基因诊断和个性化医疗分析的技术平台。

2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性掺入DNA双链，并发出荧光信号，而未掺入DNA双链的SYBR染料分子则发出荧光信号。链不会发射任何荧光。信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加全同步。 SYBR 仅与双链 DNA 结合，因此熔解曲线可用于确定 PCR 反应是否具有特异性。

3、分子信标：是一种茎环双标记寡核苷酸探针，在5、3端形成约662个碱基的发夹结构。两端的核酸序列互补配对，导致荧光团和猝灭基团非常接近并且不发出荧光。 PCR产物生成后，在退火过程中，分子信标的中间部分与特定的DNA序列配对，荧光基因和猝灭基因分离，产生荧光[1]。

传统定量PCR

1. 传统定量PCR方法介绍

1）内参法：将定量的内标和引物加入到不同的PCR反应管中，通过基因工程方法合成内标。上游引物有荧光标记，下游引物没有荧光标记。在扩增模板的同时，内标也被扩增。 PCR产物中，由于内标和目标模板的长度不同，可以通过电泳或高效液相分离两者的扩增产物，并分别测定它们的荧光强度，内标可以用作定量待检测模板的对照。
2）竞争法：选择含有突变克隆产生的新内切酶位点的外源竞争模板。在同一反应管中，用同一对引物（其中一个引物带有荧光标记）同时扩增待测样品和竞争模板。扩增后，PCR产物用核酸内切酶消化，竞争模板的产物被消化成两个片段，而待测模板则不被酶切。可以通过电泳或高效液相分离两种产物，并可以单独测量荧光强度，根据已知模板推断未知模板的初始拷贝数。
3）PCR-ELISA法：利用di高辛或生物素等标记引物，将扩增产物与固相板上的特异性探针结合，然后加入抗di高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化反应。底物酶结合，最后酶使底物显色。常规的PCR-ELISA方法只是定性实验。若加入内标物制作标准曲线，也可达到定量检测的目的。

2. 内标在传统定量中的作用

由于传统的定量方法是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而当PCR通过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR机上重复96次，得到的结果相差很大，因此无法直接从终产物的量计算出起始模板的量。通过添加内标可以部分消除最终产品定量造成的误差。但即便如此，传统的定量方法也只能算是半定量和粗略的定量方法。

3.内标对定量PCR的影响

如果在待测样品中加入初始拷贝数已知的内标，则PCR反应变成双PCR，双PCR反应中两个模板之间存在干扰和竞争，特别是当内标的初始拷贝数为已知的内标时。两个模板差异比较大的时候，这种竞争就会更加显着。但由于待测样品的初始拷贝数未知，因此无法添加适量的已知模板作为内标。也正是因为这个原因，传统的定量方法虽然增加了内标，但仍然只是一种半定量方法。

实时定量PCR

实时荧光定量PCR技术有效解决了传统定量仅终点检测的局限性，实现每个循环检测一次荧光信号强度，并记录在计算机软件中，通过计算Ct值对每个样品，根据标准曲线获得定量结果。因此，无内标实时定量PCR基于两个基础：
1）Ct值的重现性 当PCR循环达到Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增阶段（对数阶段）。此时，微小的误差还没有被放大，因此Ct值的重现性好。 ，即同一个模板在不同时间扩增或者在不同管中同时扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系 由于Ct值与起始模板的对数之间存在线性关系，因此可以利用标准曲线来定量测定未知样品。因此，实时荧光定量PCR是一种利用外标曲线的定量方法。方法。
与内标法相比，外标曲线定量法是一种准确、可靠的科学方法。使用外标曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止最准确、重现性好的定量方法。已得到世界的认可，广泛应用于基因表达研究、转基因研究、药效评估、病原检测等领域。

实时荧光定量PCR的定量方法

在实时PCR中，模板定量有两种策略：相对定量和绝对定量。

实时荧光定量PCR相关应用

临床疾病诊断

各类肝炎、艾滋病、流感、肺结核、性病等传染病的诊断及疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育不良、智力低下综合征、胎儿畸形的优生学和产前检查；肿瘤标志物和肿瘤基因检测实现肿瘤疾病的诊断；基因检测实现了遗传病的诊断。

动物疫病检测

流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门氏菌、大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽杆菌。

食品安全

乳制品企业中食品源性微生物、食品过敏原、转基因生物、坂崎肠杆菌的检测。

科学研究

与医学、农牧业、生物学相关的分子生物学定量研究。

应用行业

各级各类医疗机构、大专院校及科研院所、疾控中心、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。由于qPCR是病原基因核酸的实时定量检测，因此
具有更多的特性。与化学发光、时间分辨率、蛋白芯片等免疫学方法相比具有优势。