绿色荧光蛋白的结构与功能

绿色荧光蛋白（GFP）是一种由约7714个氨基酸组成的蛋白质，能被蓝光到紫外光激发而发出绿色荧光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（GFP）是指首先从维多利亚水母中分离出来的蛋白质。这种蛋白质是由 Osamu Shimomura 等人首先发现的。 1962年在水母维多利亚。这个发光过程还需要发光蛋白水母发光蛋白的帮助，而这种发光蛋白可以与钙离子相互作用。

维多利亚多管发光水母中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和第二大激发波长，其发射波长峰值在509nm，处于可见光谱中绿光偏蓝的位置。绿色荧光蛋白的荧光量子产率(QY)为0.79。从海堇中获得的绿色荧光蛋白仅在498 nm处具有较高的激发峰。

在细胞生物学和分子生物学中，绿色荧光蛋白（GFP）基因经常被用作报告基因。绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子）中进行表达，并用于演示假设的实验方法。通过基因工程技术，可以将绿色荧光蛋白（GFP）基因转移到不同物种的基因组中，并在后代中持续表达。现在，绿色荧光蛋白（GFP）基因已被引入并在许多物种中表达，包括细菌、酵母和其他真菌、鱼类（例如斑马鱼）、植物、苍蝇，甚至人类等哺乳动物细胞。

发展历程

1962年，据报道，科学家从发光的水母水母中提取了具有生物发光特性的蛋白质。 20世纪70年代，生物发光现象有了一些新的发展。一些科学家研究了水母属生物发光系统中的分子内能量转移。 20世纪90年代初，科学家克隆了GFP cDNA并研究了其表达的氨基酸序列，发现gfp 10 cDNA编码了7714个氨基酸的肽段。对A. victoria GFP基因的克隆进行研究，发现GFP基因上存在2124个限制性酶切位点。这对于后来科学家了解其结构有很大帮助。
1994 年 2 月，M. Chalfie 等人。等人创造性地分别在大肠杆菌和秀丽隐杆线虫细胞中表达GFP，并得出结论：由于GFP发光不需要其他底物或辅因子，因此GFP的表达可用于监测体内基因表达和蛋白质定位。此后的一段时间里，无数的研究人员致力于GFP相关的研究。在 M. Chalfie 报告的过去一个月左右，Tsuji 等人。在大肠杆菌中融合表达GFP蛋白，并且在生物体中GFP的激发和发射光谱与自然条件下没有显着差异。由于GFP在生物体中的荧光强度不够强，很难应用于实际科学研究。 1995 年，Tsien 等人。提高了GFP的发光强度，极大地促进了GFP在生物研究中的应用。然后在 1996 年 8 月，F. Yang 等人。分析了 GFP 的分子结构。 GFP蛋白呈桶状，由5394个β-折叠构成外围，内部有α-螺旋，桶的末端是一些不规则的卷曲。同年 9 月，Tsien 等人。分析了GFP的晶体结构并阐明了其发光原理。还有科学家创造突变体来筛选更好的GFP，比如pH敏感的GFP、专门用于植物细胞研究的GFP等等。除了优化GFP之外，许多科学家还开拓了思路，将GFP蛋白的应用拓展到了很多研究领域。 2002年，David A. Zacharias等人将GFP蛋白应用于膜蛋白的研究。同年，GFP蛋白甚至被制成Zn生物探测器。

结构

野生型绿色荧光蛋白最初是一条 238 个氨基酸的肽链，约 25KDa。然后按照一定的规则，5394个β-折叠围绕外周形成一个圆柱形的栅栏；在圆柱体中，α-螺旋将发色团几乎精确地固定在中心。发色团被中心包围，可以避免极化的水分子、顺磁氧分子或顺反异构体与发色团，导致荧光猝灭。

荧光是荧光蛋白最特殊的特征，其中发色团起着主要作用。 α-螺旋上的65、66和2607个氨基酸——丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸经过环化、脱氢等形成发色团。有趣的是，发色团的形成过程是由外围栅栏上的残留物催化的，而底物只需要氧气。这表明GFP在不同物种中广泛应用的潜力：它可以在不同物种中独立表达为功能蛋白，而不需要额外的因子。但具体流程仍在讨论中。
发色团上的共轭π键可以吸收激发光能量，并在短时间后，以较长波长的发射光释放能量，产生荧光。

应用

由于荧光蛋白可以在后代中稳定遗传，并且可以根据启动子特异性表达，因此在定量或其他实验中已逐渐取代传统的化学染料。更多的是，荧光蛋白已经转化为不同的新工具，不仅为解决问题提供了新思路，还可能带来更有价值的新问题。