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1.简介
缝合和缝合技术数百年来一直是临床标准，尽管它们有缺点。缝合取决于技能，并且在应用中相对较慢（Durkaya等人，2005）。用生物相容性液体胶代替将使经过培训的急救人员能够快速干预。生产合适的无毒胶水配方需要克服许多障碍，因为设计参数需要采用一种对一般用途安全的简化方法。理想的组织粘合剂在应用中应该是液体，立即交联成机械兼容的薄膜，即使在界面水层存在的情况下也能形成组织共价键。（巴加特和贝克尔，2017）。目前，没有商业纸巾粘合剂满足这些要求， 但是基于卡宾的交联方法试图解决当前的缺陷。
卡宾是短寿命的中间体，通过分子X-H插入非选择性地插入分子（包括水/溶剂分子）中，非选择性地形成共价键（Brunner等人，1980）。卡宾前体二吖啶已被接枝到树枝状聚合物上，例如聚酰胺胺（PAMAM），从而产生水溶性PAMAM-g-二吖啶（PDz）粘合剂。树枝状聚合物是一个关键的设计选择——它们避免了聚合物缠结，允许在低粘度下使用高溶质配方。由于 UVA 活化的二嗪碱快速解离到卡宾，PDz 粘合剂具有快速固化（< 1 分钟）、可调弹性并粘附在湿基材上以实现组织粘合应用（Mogal 等人，2014a;冯等人，2016）。 芳基二吖啶共轭（接枝）到第五代树枝状聚合物（G5-PAMAM，28 kDa）上，在水介质中实现液体到弹性体的光活化转变。尽管有这些吸引人的特性，PDz胶粘剂仍有局限性需要克服。除去水后，纯PDz是一种粘性液体，粘度（>50 Pa s）（Shah等人，2019）限制了基于注射器的应用，表面润湿和粘附强度（< 10 kPa）（Feng等人，2016）。水的存在（O-H插入）与组织表面的树突状分子和蛋白质之间的交联竞争。导致粘合强度弱（Nanda等人，2018）。这种效应部分是通过用液体低聚物/聚合物（如低分子量聚乙二醇（PEG Mw = 400 Da;在文本中进一步缩写为PEG400）代替水来介导的（Shah等人， 已知PAMAM树枝状聚合物可与液体PEG400混溶，形成均匀的聚合物混合物（Ristić和Mijović，2009;纳塔利和米约维奇，2009 年）。在这些发现的激励下，我们生产了 PDz 和液体 PEG400 的二元混合物，与最初构思的水性 PDz 配方（Nanda 等人，2018 年）相比，机械模量提高了 5 倍（Shah 等人，2019 年）。
二元 PDz/PEG400 配方以前已证明剪切模量高于 100 kPa，PDz 含量为 70%，但如此高的溶质浓度 （PDz） 将粘合剂性能限制在 5 kPa（Shah 等人，2019 年）。根据10-400 kPa范围内的软组织弹性模量的变化选择10-100 kPa的目标模量（Saraf等人，2007）。根据商业/临床批准的基于纤维蛋白的粘合剂的粘合强度选择10 kPa的目标粘合强度（Lang等人，2014）。为了在较低的溶质含量下实现更高水平的湿粘合，PDz/PEG400二元胶粘剂采用三级高分子量PEG（2 kDa、6 kDa和10 kDa）重新配制，以增加分子间树枝状架桥的可能性， 从而增加内聚强度，同时最小化纯PDz的动态粘度。该策略利用了卡宾优先插入H-O-键而不是H-C-键的观察结果（Blencowe等人，2008;莫斯，2006 年）。因此，假设原始PDz/PEG400负载长线性分子链的PEG（Mn = 2 kDa，6 kDa和10 kDa）会增加模量和粘附强度。三级共混 （TB） 粘合剂配方是通过将高分子量 PEG 聚合物与二元 PDz/PEG400（TB 控制）粘合剂混合而获得的。表1列出了结核病制剂中大分子的百分比重量（% w/w）及其各自的命名法。 莫斯，2006 年）。因此，假设原始PDz/PEG400负载长线性分子链的PEG（Mn = 2 kDa，6 kDa和10 kDa）会增加模量和粘附强度。三级共混 （TB） 粘合剂配方是通过将高分子量 PEG 聚合物与二元 PDz/PEG400（TB 控制）粘合剂混合而获得的。表1列出了结核病制剂中大分子的百分比重量（% w/w）及其各自的命名法。 莫斯，2006 年）。因此，假设原始PDz/PEG400负载长线性分子链的PEG（Mn = 2 kDa，6 kDa和10 kDa）会增加模量和粘附强度。三级共混 （TB） 粘合剂配方是通过将高分子量 PEG 聚合物与二元 PDz/PEG400（TB 控制）粘合剂混合而获得的。表1列出了结核病制剂中大分子的百分比重量（% w/w）及其各自的命名法。 表1列出了结核病制剂中大分子的百分比重量（% w/w）及其各自的命名法。 表1列出了结核病制剂中大分子的百分比重量（% w/w）及其各自的命名法。
PDz的浓度在所有研究的配方中保持恒定，以评估长链PEG对TB机械和粘合剂性能的影响。通过实时光流变测量和搭接剪切粘附在湿组织模拟（水合胶原蛋白）底物上的力学性能来研究TBs的机械性能。此外，还介绍了UVA交联结核在水性介质（盐水缓冲液）中的浸出液的肿胀和总体百分比。
2.材料和方法
2.1.材料
G5-PAMAM （Mn = 28.8 kDa） 树枝状聚合物购自美国Dendritech。3-[4-（溴甲基）苯基]-3-（三氟甲基）二嗪（简称“二氮丙啶"）购自日本TCI。甲醇和聚乙二醇（PEG，Mn = 400 Da，2 kDa，6 kDa和10 kDa）从Sigma Aldrich购买并按收到使用。Dermabond™组织粘合剂是从Ethicon购买的。胶原蛋白薄膜购自新加坡日比薄膜。
2.2.粘合聚合物共混物的制备
使用先前发表的方法将二吖啶接枝到G5-PAMAM树枝状聚合物（20个表面胺官能团）上（Nanda等人，2018）。简而言之，将1000mgPAMAM和181.75mg二吖啶在200mL甲醇中搅拌12小时，以实现PDz的15%偶联。偶联百分比计算为伯胺和二吖啶之间的比率。将甲醇（50%）中的PDz溶液与纯（液体）PEG400混合。该混合物进一步与5%PEG溶液（2kDa，6kDa或10kDa）混合，重量比不同，如表1所示。将溶剂（甲醇）在37°C的真空烘箱中除去96小时。PDz和PEG400的二元混合物以30：70 wt的比例在所有测量中用作对照（TB对照）。
2.3.动态力学性能和固化动力学
通过光流变测量法实时评估 UVA 照射下 TB 的材料特性（存储、G′ 和损耗模量、G）（图 1a，Physica MCR 501，美国安东帕）。流变仪连接到 365 nm UVA 源（Omnicure S1000、SG），并以 200 mW cm−2 的恒定功率照射样品。实验参数固定在1 Hz下的1%应变，间隙厚度为100 μm（23°C）。测试样品用10毫米不锈钢平行板剪切。TB的动态粘度在60 s时通过将G“除以角频率（G"/ω）计算。凝胶点定义为G“ = G'（或tan δ = 1）所需的时间/UV剂量。
2.4.扫描电子显微镜（SEM）成像
光固化结核的表面形貌是通过两种聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜（2×2cm）之间的20毫克共混物以20J cm−2的有效剂量（PET薄膜反式
任务损失 ∼ 30%）。粘性断裂表面涂有金涂层
30 秒，用 SEM （Joel 6630） 记录，加速电压设置为 1 kV，工作距离为 11 mm。
2.5.肿胀和质量损失研究
通过将7.5 μL（5–10 mg）未固化的粘合剂移液在两个1 cm2 PET薄膜之间，评估交联结核病的肿胀率（%），这些PET薄膜以20 J cm−2的有效UVA剂量进行光固化（在200 mW cm-2下持续100秒）。剥离PET薄膜夹层结构，将交联结核的粘性断裂表面浸入
磷酸盐缓冲盐水（PBS;pH 7.4）在37°C下5和15分钟。粘性断裂的表面允许最大的表面积，以实现快速的水膨胀。在记录水合样品的质量之前，用不起毛的纸去除多余的水分。溶胀百分比通过称量溶胀样品（Mw）相对于干交联粘合剂（M0）的质量来计算：溶胀%=[（Mw - M0）/M0]*100。类似的实验设计用于通过测量样品浸入PBS60 min后的残余重量来间接确定渗滤液的量。残余重量计算如下：% Res. W. = [（M0 – Mr）/M0]*100，其中Mr表示在PBS中穿模后的样品重量。
2.6.搭接剪切粘合强度
光固化基体的粘合强度基于ASTM标准F2255-05。每种基材（胶原蛋白+玻璃和PET+玻璃）的制备方法如下：将胶原膜和PET膜（2×2cm2;厚度0.02mm）分别用双面胶带粘附在载玻片上。在测试前将胶原底物在37°C的水中孵育。将10毫克未治愈的结核病涂抹在PET表面上并夹在水合胶原蛋白表面上，形成“三明治结构：玻璃/ PET / TB /胶原蛋白/玻璃。三明治通过回形针固定，并通过玻璃/PET透明光固化
有效剂量为20J cm−2（照射功率为200 mW cm−2，持续100秒）的亚启动剂。基板温度偏差不超过2°C（数据未显示）。剪切粘合强度是使用拉伸测试仪（Chatillon力测量产品，美国）获得的。搭接夹层在 50 N 加载单元中承受 3 mm min−1 的拉伸应变速率。搭接剪切粘附强度的计算方法是将
总粘附面积的失效载荷（4 cm−2）。对于阳性对照，二元粘合剂（结核病控制;表1）用有效剂量为20Jcm−2和Dermabond™（2分钟固化时间）对水合胶原膜固化。
2.7.统计分析
实验一式三份进行，包括光流变测量、粘附、溶胀和失重研究。统计分析是使用单因素方差分析（OriginPro软件）对数据集进行的，并且在*p < 0.05时具有显著性。记录了很强的相关性（皮尔逊的r）：r>0.7为正，r>-0.7为负或反比。
3.结果和讨论
3.1.TB胶粘剂的有效模量可调谐至250 kPa，PDz含量为30%
添加液体PEG400可将纯PDz（15%接枝二嗪）的粘度降低三个数量级; 从 55，000 mPa s 增加到 75 mPa s（Shah 等人，2019 年），在使用高 Mn PEG 进行加固时增加到 27，000 mPa s。如图所示。2b，TB-2K（1），TB-6K（1）和TB-10K（1）具有相似的粘度（165-225 mPa s），而不受PEG链长的影响。此外，低浓度PEG TB符合Cilurzo等人使用21G针（≤250 mPa s）的糖浆可检测性标准（Cilurzo等人，2011年）。高浓度PEG TBs的粘度：TB-2K（10），TB-6K（10）和TB-10K（10）随PEG链长的函数而增加，具有很强的正相关关系（Pearson's r：0.995）。高粘度TB（最多10，000 mPa s）仍然可以在交联之前通过刮刀或用锥形注射（Fischer和Fischer，1995）。当前配方设计的部分动机是广泛的适用性和简单的方法，例如急救人员所需的方法。在这方面，生物粘合剂将在环境温度下储存并在环境温度下激活 - 因此，所有测量都是在20至25°C的环境温度下进行的。
从图所示的光流变曲线中观察到暴露于UVA光时的交联动力学。1c和d。由于卡宾诱导的分子间交联，G′和G“模量立即增加。卡宾通过X-H插入与其附近环境中的分子共价交联。在TB的情况下，卡宾主要插入来自PAMAM树状聚合物的表面暴露的伯胺，来自共混物中任一聚合物的–OH端基（PEG）和–CH2-基团。如图所示，与（TB对照）相比，引入高Mn PEG对凝胶时间的影响有限。1e.凝胶时间不显示固定浓度（1%或10%）下增加的Mn PEG（从2 kDa到10 kDa）的依赖性。TB在交联饱和时达到99%的G′，UVA剂量为10J cm−2，G′在35-250kPa之间（图1f）。 请注意，TB-10K （10）、（248 ± 14 kPa） 的 G' 值与纯溶剂和不含 PEG 的 PDz （245 ± 25 kPa） 相关，并且比 TB 对照组 （40 ± 2 kPa） 高一个量级，两者都用 60 J cm−2 的 UVA 剂量固化（Shah 等人，2019 年）。
结果表明：PEG链长和配固比（1%或10%w/w比;表1）以匹配人体软组织的比剪切模量，例如胃（8-45 kPa），心室心壁（60-148 kPa）和肝脏（37-340 kPa）（Saraf等人，2007）。 Vakalopoulos等人在与本文采用的光流变测量法（1 Hz，1%应变）相似的条件下测量了固化商业粘合剂和密封剂的剪切模量，发现固化的Dermabond™（氰基丙烯酸酯）的G′为40 MPa，Bio-glueTM（双组分，BSA/戊二醛）为25 MPa，Evicel™（纤维蛋白）为2 MPa，Tissucol™（纤维蛋白）为0.6 MPa（Vakalopoulos等人， 2015），比软组织的G′值高出42个数量级（Valtorta和Mazza，2005;尼科尔和帕利恩，2010 年）。 结核病制剂表现出与软组织相似的G'范围或至少具有相同的数量级（Umale等人，2013）。
除了机械模量外，粘合膜变形文件还应模拟组织的应力-应变J曲线。特别是，成膜聚合物粘合剂在施加应力下应表现出应变硬化行为。匹配的组织弹性以及变形曲线可以防止组织/粘附界面处的应力集中并阻止界面粘附失效。当粘合剂在动态应力（例如血管）下施加在软组织上时，此功能特别重要。血管的弹性模量与应变有关，范围从40mmHg时的100kPa到220mmHg时的1MPa（Peterson等人，1960;伯格尔，1961年;默多克等人，2019 年）。如图所示。1克， 所有光固化TB均表现出对应力的应变硬化响应，具有线弹性胡克样行为，并且在生理相关的机械载荷（150 mmHg = 20 kPa）下不会失效。光固化结核在10-30%剪切应变范围内表现出应变硬化行为的起始，失效应力直接受光固化结核模量（G'）的影响。
为了证明光固化TB具有应变依赖性G'，将高达10%应变和10-30%应变的剪切应力-应变曲线线性拟合以获得平均G'值。线性拟合用于G'和所有胶膜的粗略估计，其棕褐色δ <0.1，因此主要被认为是弹性的。如图所示。1小时，1–10%应变下的G'值仅受高Mn PEG浓度的影响，而不受PEG链尺寸（Mn）的影响。在10–30%剪切应变下，记录的G'分别达到TB-2K（10）、TB-6K（10）和TB-10K（10）的12 kPa、27 kPa和53 kPa值。
3.2.PEG 6K和10K增强TB的相互连接的多孔形貌
由于二吖啶UVA活化到卡宾，分子氮的演变导致聚合物基质内起泡，从而形成明确的多孔结构（图2a-h）。纯PDz（图2g）每个表面的孔径为∼50 μm，具有最多的孔数。当与PEG400（TB控制;无花果。3h） 与其他聚合物共混物相比，二吖啶的 UVA 活化导致最大孔径 （> 300 μm）。光固化TB（图2a-f）显示出明确的多孔结构，具有相当均匀的孔径。对于高浓度聚乙二醇：TB-2K（10）、TB-6K（10）和TB-10K（10），孔径随着聚乙二醇分子量的增加而减小（图2b，d，f）。这很可能是初始粘度和氮气溶解度之间的协同作用的结果， 这与PEG的分子量无关（Wiesmet等人，2000年）。一旦氮气成核，粘性就会抵抗孔的初始膨胀。当气体以更快的速度通过PEG400扩散时（与较高的Mn PEG相比），气体逸出导致更小的相互连接的孔（图2d，f）。孔径和孔隙率的平衡对于组织再生至关重要，其中孔径的控制导致多孔支架网络内的最佳组织形成（Loh和Choong，2013;吴等人，2018）。 孔径和孔隙率的平衡对于组织再生至关重要，其中孔径的控制导致多孔支架网络内的最佳组织形成（Loh和Choong，2013;吴等人，2018）。 孔径和孔隙率的平衡对于组织再生至关重要，其中孔径的控制导致多孔支架网络内的最佳组织形成（Loh和Choong，2013;吴等人，2018）。
3.3.TB在10%PEG增强下比TB对照制剂具有更少的肿胀
光固化结核表现出与二元结核对照相似的溶胀行为。如图所示。3a，高锰PEGs的低浓度负荷（1%）显示出随着时间的推移而显着增加的百分比膨胀，在5分钟和15分钟点测量：TB-2K（1），（从160±6到210±30%）和TB-6K（1），（从140±6到230±15%）。即使在15分钟后也观察到立即浸出。TB-10K（1）的吸水率从250±35（5分钟）下降到190±20%（15分钟）。高浓度PEG TBs的肿胀（图3b）在5至15分钟之间没有统计学差异。在PBS（pH = 7.4）中孵育1小时后，与TB对照相比，从TB中浸出的未反应聚合物量较低（即残留重量百分比较高;无花果。3c）. –OH基团的相对浓度随着TB中高Mn量的增加而降低， 这直接影响卡宾共价插入PEG链的位点。如图所示。3c，35-45%的交联结核仍然粘附在PET片上。与TB对照相比，四种TB，即TB-2K（1），TB-6K（10），TB-10K（1）和TB-10K（10）导致更高的界面交联（与PET基材），如更高的质量保留所表明的那样。
一般来说，PAMAM树枝状聚合物和PEG聚合物在水合环境中会膨胀。与二元结核对照相比，引入具有固定PDz含量的高Mn PEG预计将诱导更高的肿胀率（Yuan等人，2017）。然而，由于肿胀率在统计学上是均匀的，因此没有观察到这一点。在六种配方中，只有TB-10K（10）表现出统计学上的较高肿胀。这一观察结果与我们之前发表的结果一致，其中膨胀率与 PEG400 含量无关，在与 PDz 的二元混合物中高达 50% w/w 浓度（Shah 等人，2019 年）。均匀的膨胀对营养物质运输的影响有限（Park等人，2009），使混合物成为加载疏水药物和蛋白质的有吸引力的载体。 用PEG链克服树枝状聚合物的阳离子电荷将进一步允许聚合物基质内更安全的细胞封装。质量保留的改善可归因于卡宾进入PEG主链的脂肪族结构域。未交联的PEG400预计将从聚合物混合物中浸出，而由于更高的交联密度，高Mn PEG预计将保留在光固化基质中。
3.4.高锰PEG增强增加搭接剪切粘合强度
液体结核粘合剂用净365nm UVA剂量20J cm−2照射。选择该剂量有两个原因;1） 20 J cm−2 可实现 99% 的储能模量（从光流变测量结果中可以明显看出;无花果。1 a，c，d） 和 2），最大暴露剂量 20 J cm−2 是防止皮肤红斑反应的上限，定义如下：
国际非电离辐射防护委员会发布的紫外线照射指南（Wan等人，2012年;保护和I.C.O.N.-I.R.，2004年）。搭接剪切应力/应变曲线如图所示。4一.粘合强度由失效点确定，并在图中比较值。4b.
光固化TBs的搭接剪切粘附强度（25–45 kPa）在统计学上高于二元TB对照（17 ± 2 kPa;无花果。4b）. 光固化 TB-2K（1） 和 TB-10K（1） 观察到剪切强度值分别为 45 ± 3 kPa 和 35 ± 1 kPa，并且与 2 分钟固化的 Dermabond™ 胶 （23 ± 8 kPa; 无花果。4b）. TBs实现的粘附优于GRF/戊二醛（24.5 kPa）（Shojiro等人，1999年）和纤维蛋白胶（14 kPa），但是，应该注意的是，这些值在不同底物上会有所不同（Lauto等人，2008年）。胶粘剂性能的提高并不伴随着光固化TB机械性能的改善。对于TB-2-10（1）配方，动态粘度和G'是相似的，但与TB-2-10（10）系列相比显示出*的粘合性能。 这归因于改进的卡宾诱导与PEG链-CH2基团的交联。在PEG分子中，平均单体长度近似为0.278nm（Oesterhelt等人，1999），PEG400的计数器长度为3.1nm（Ma等人，2014），小于G5-PAMAM树枝状聚合物（∼5nm）的直径（Maiti等人，2004）。因此，树枝状聚合物分子之间（自交联）或树枝状聚合物和PEG400（聚合物复合交联）之间都可以交联。 树枝状分子之间（自交联）或树枝状聚合物与PEG400（聚合物复合交联）之间都可以交联。 树枝状分子之间（自交联）或树枝状聚合物与PEG400（聚合物复合交联）之间都可以交联。
使用更长的PEG链加强TB控制应该增加实现更高交联密度的可能性，因为与PDz直径相比，增强PEG具有更长的计数器长度。基于单体长度，PEG 2 kDa、6 kDa和10 kDa的计数器长度分别近似为12.7 nm、38.1 nm和63.1 nm（Ma等人，2014）。随着链长的增加，多个PDz树枝状聚合物可以插入到单个PEG链上，从而形成更加相互连接的基质。液体PEG400赋予交联基质可塑性，但用PEG 2K-10K部分替换会增加失效前所需的位移和总功（如1%组合物所示）。随着PEG尺寸的增加，交联TB在较低的剪切应变下失效，但长聚合物链为能量耗散提供了缠结和节点， 这可能解释了TB在失效前处理更高剪切应力的能力。手稿中的一些限制是主要成分的未解决毒性。然而，我们之前已经证明，没有PEG的PDz皮下植入物显示出中度的免疫反应，可以通过胺封盖来缓解（Nanda等人，2018;高等人，2018）。其他人已经证明，纯聚阳离子PAMAM树枝状聚合物不会从注射部位迁移，因此在直接植入区域之外几乎没有风险（Niki等人，2015）。其他限制包括配方仅限于的湿基质。PEG的混溶性可防止浸入或水下应用。应该注意的是，这些制剂不限于光活化， 但也可以通过适当接枝官能团而被电压激活（Singh等人，2018;平等人，2015b;甘等人，2018）。通过生物粘附和PEG加速药物递送的组合，制剂可能超过以前使用聚酯短期药物递送的效率（Cheng等人，2015;斯蒂尔等人，2013 年;莫加尔等人，2014b）。
4.结语
液体聚合物粘合剂混合物由二吖啶接枝枝状聚合物和不同大小和浓度的PEG大分子制成。这些生物粘合剂配方与低剂量的UVA光快速交联，从而形成弹性膜。交联混合物的机械特性模仿软组织的机械特性，从而使它们成为加强或替代缝合线和订书钉的潜在候选者。动态模量和粘合强度取决于PEG添加剂的分子量，可以通过UVA光强度和PEG组分的相对浓度进行调整。这种液体-固体聚合物复合材料可用于释放治疗剂、修补组织或在未来的外科手术中的组合。
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